Deleção de genes de resistência à antibióticos em fibroblastos por crispr/cas9 para a produção de caprinos transgênicos para lactoferrina humana [Digital]
Dissertação
Português
612.392.4
Fortaleza, 2021.
O sistema CRISPR/Cas9 se tornou uma ferramenta muito utilizada devido a sua simplicidade e baixo custo quando comparada a outras ferramentas para edição genômica. O gene da Lactoferrina humana foi inserido no DNA de caprinos transgênicos juntamente com a resistência ao antibiótico neomicina. O...
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O sistema CRISPR/Cas9 se tornou uma ferramenta muito utilizada devido a sua simplicidade e baixo custo quando comparada a outras ferramentas para edição genômica. O gene da Lactoferrina humana foi inserido no DNA de caprinos transgênicos juntamente com a resistência ao antibiótico neomicina. O objetivo do presente projeto foi remover o gene de resistência a antibiótico a partir do genoma dos caprinos transgênicos utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Foram utilizadas CRISPR/Cas9 com a menor possibilidade de off-targets, flanqueando a região onde está inserido o cassete de resistência. Fibroblastos transgênicos foram transfectados com CRISPR/Cas9 (UP1 e DOWN3). Os fibroblastos transfectados foram selecionadas por diluição e, após a marcação de prováveis colônias puras, foram enviados para realização do diagnóstico por PCR para identificação da deleção desejada. Foi realizado o plaqueamento celular em 10 placas de 96 poços, a partir das quais foram testadas 96 colônias prováveis colônias puras. O sistema CRISPR/Cas9 desenhado nesse estudo para a remoção do gene de resistência à neomicina não se mostrou eficiente diante da não identificação do evento de deleção desejado a partir das colônias de fibroblastos analisadas por PCR.
Palavras-chaves: CRISPR/Cas9; Edição Gênica; Lactoferrina Humana. Ver menos
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The innovation of new ways of gene editing has proven to be more and more efficient, one of them that has been gaining attention is CRISPR, which is a system that makes it possible to edit genomes, deleting or inserting desired characteristics. The human Lactoferrin trait was inserted into the DNA...
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The innovation of new ways of gene editing has proven to be more and more efficient, one of them that has been gaining attention is CRISPR, which is a system that makes it possible to edit genomes, deleting or inserting desired characteristics. The human Lactoferrin trait was inserted into the DNA of transgenic goats along with resistance to the antibiotic neomycin. The study had the objective of removing the persistent antibiotic neomycin resistance gene in fibroblasts collected from LACh transgenic goats, through the construction of a CRIPPR system that surround the region where the resistance cassette is inserted, being chosen those that have the least chance of off -targets. They were transfected with 2 uL of each CRISPR/Cas9 (UP1 and DOWN3) using the Neon Transfection System® (Thermo Scientific) electroporator. With cells growing in the wells, DNA extractions from these cells were performed so that colony PCRs could be performed to confirm the desired deletion. Concluding that the CRISPR/Cas9 system for removing the neomycin resistance gene produced, designed and in an attempt to validate, apparently was not very efficient. Keywords: CRISPR/Cas9; Gene Editing; human lactoferrin.
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Silva, Gabriela Maciel
Autor
Martins, Leonardo Tondello
Orientador
Tavares, Kaio Cesar Simiano
Banca examinadora
Teixeira, Louhanna Pinheiro Rodrigues
Banca examinadora
Universidade de Fortaleza. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas
Dissertação (mestrado)